Nie ujawniono szczegółów finansowych umowy z 35-krotnym reprezentantem Włoch. Ambrosini po raz pierwszy założył koszulkę Milanu w sezonie 1995/96, gdy przeszedł do Mediolanu z Ceseny, której jest wychowankiem. W nowym klubie zadebiutował 30 sierpnia 1995 roku w wygranym 4-1 meczu z Pescarą. Sezon 1997/98 spędził w innym włoskim zespole - Vicenza Calcio (rozegrał 27 meczów). Po powrocie na San Siro zaczął grać regularnie. W barwach AC czterokrotnie zdobył mistrzostwo Włoch (1996, 1999, 2004, 2011), dwukrotnie wygrał Ligę Mistrzów (2003, 2007). Opaskę kapitana przejął po Paolo Maldinim, który w czerwcu 2009 roku zakończył karierę sportową.